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  基于片段方法设计的NSD3-PWWP1结构域拮抗剂组蛋白翻译后修饰是表观遗传调控的重要部分,主要包括乙酰化、磷酸化和甲基化修饰等。这些修饰可被多结构域组蛋白修饰酶的靶向特定结构域的选择性化学探针,▼▼▽●▽●成为研究表观遗传调节因子生物学功能的有力工具,同时也为药理学研究提供概念验证,◆●△▼●进而转化为抗肿瘤药物。

  NSD3是NSD(Nuclear Receptor Binding SET Domain)家族蛋白赖氨酸甲基转移酶的一种,由位于8p11-p12扩增子的WHSC1L1基因编码,常在乳腺癌和肺鳞癌中表达增多。NSD3是一种多结构域蛋白,存在long、short和睾丸特异性Whistle三种亚型。NSD3-long和Whistle亚型均含有SET结构域,具有赖氨酸甲基转移酶活性,以及多个染色质reader结构域,包括PHD和PWWP结构域。NSD3-short亚型仅含有第一个PWWP结构域。近期研究表明NSD3-short作为一种接头蛋白,▲●将BRD4偶联到染色质重塑CHD8上。该功能依赖于PWWP1结构域。●NSD3的PWWP1是急性髓系白血病(AML)细胞存活所必需的。但至今仍没有靶向PWWP1结构域的化学探针。近日,来自勃林格殷格翰公司的药物研发人员在Nature ChemicalBiology上报道了基于片段筛选发现具有细胞活性的选择性NSD3甲基转移酶PWWP1结构域(NSD3-PWWP1)拮抗剂BI-9321。

  研究人员首先针对NSD3的截短体(残基247-398)利用饱和转移差谱NMR(STD-NMR)和差示扫描荧光法(DSF)筛选了1899个化合物的专有片段库,得到302个hit。为了区分多个潜在的结合位点,研究人员通过加入二甲基组蛋白H3K36肽(H-STGGV-Lys(me2)-KPHRY-OH)后特定的化学位移扰动模式标出了甲基赖氨酸结合位点,最终从302个hit中得到15个交叉峰化学位移扰动与二甲基组蛋白H3K36肽相似的hit。研究人员利用二维15N TROSYNMR滴定试验测定了15个hit的Kd,□▼◁▼并对Kd小于2 mM的化合物进行共晶和浸泡(soaking)试验。只有结合模式经过蛋白晶体确认的化合物才进行后续研究。研究人员利用硒代半胱氨酸标记变体解析了NSD3-PWWP1(残基247-398)结构域的晶体结构,并设计了一个新的截短体(残基263-398)用于X-射线晶体衍射。该截短体仅在化合物3(NMR; Kd=1700μM)存在时得到晶体。用这些晶体浸泡进一步得到化合物4(NMR; Kd=330μM)和化合物5(NMR; Kd=650 μM)的共晶。▲●…△将化合物4和5作为SAR目录检索模板,使用内部建立的基于配体的虚拟筛选框架Morhits,对勃林格殷格翰化合物库进行虚拟筛选,对得到的601个虚拟筛选hit进行SPR单点筛选,后续测定了108个化合物的Kd。其中,活性最好的hit8含有甲基咪唑核心,与检索模板结合在相同的结合位点,作为新的优化起点。

  基于结构,研究人员对甲基咪唑类化合物进行优化,主要是甲基咪唑核心的4-和5-取代基部分。最终,在4位引入3,5-二甲基苯胺取代基,5位引入7-氟喹啉基得到活性最强的NSD3-PWWP1拮抗剂BI-9321。研究人员利用SPR和ITC两种方法证实了BI-9321的体外活性(SPR; Kd=166 μM, ITC; Kd=445μM)。BI-9321对PWWP蛋白家族、○▲甲基赖氨酸结合结构域、◇•■★▼甲基转移酶或激酶家族均没有明显的脱靶效应。•☆■▲BI-9321具有良好的药动学性质,适合作为化学探针在细胞环境研究NSD3-PWWP1的功能。同时,将结构相近但活性明显降低的类似物BI-9466作为阴性对照,排除非靶标相关效应。

  进而,研究人员利用光脱色荧光恢复技术(FRAP)、细胞分级分离和生物发光共振能量转移(nanoBRET)等多种方法证明BI-9321可以进入细胞内,并与其靶标NSD3-PWWP1结合。接下来,研究人员研究了NSD3-PWWP1拮抗作用的治疗潜力。BI-9321可抑制MOLM-13和RN2细胞的增殖,而对AML细胞系HL-60和MV4; 11没有影响,表明NSD3-PWWP1结构域维持AML增殖的作用可能受限于细胞背景环境。与所观察到的抗增殖效应一致,BI-9321可降低MOLM-13细胞MYC mRNA水平。考虑到NSD3在调节溴结构域生物学中的作用,口▲=○▼研究人员设想BI-9321是否可以增强BRD4拮抗作用。当联合处理时,BI-9321可增强JQ1在MOLM-13细胞系中的作用。这些数据表明NSD3-PWWP1抑制作为单一药物或与BRD4拮抗剂联用可作为NSD3依赖性肿瘤的治疗策略。

  综上,研究人员开发了NSD3-PWWP1结构域的first-in-class化学探针BI-9321,证明了通过小分子调控PWWP结构域的可能性。在一开始没有蛋白结构和任何已知配体的情况下,研究人员应用基于片段筛选和基于结构的优化发现BI-9321。对不同活性范围的化合物采用不同的测定方法以及通过X-射线晶体结构的指导是hit高效优化的基础。化学探针BI-9321及阴性对照BI-9466有利于增加对PWWP结构域生物学功能的理解。500万彩票

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